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研究背景
甾体是一类广泛分布于植物体内的类异戊二烯类化合物，具有17个碳原子，由三个六元环和一个五元环构成的碳骨架。甾体类衍生物对多种癌症如肝癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤具有细胞*性作用。甾体类激素-糖皮质激素是治疗慢性炎症性疾病的主要药物，高含氧类固醇是潜在的抗氧化剂、抗生素和抗癌药物。
花椒属（芸香科）有多种植物，主要分布于世界亚热带地区。在中国、日本、韩国、印度和尼泊尔，被用作调味剂。花椒（Z.bungeanumMaxim）果皮原产于中国，在甘肃、四川、陕西等地均有分布，记载中具有治疗湿疹、腹泻、呕吐、缓解上腹疼痛和杀蛔的功效。
此次研究从花椒果皮中得到了一种之前从未发现的甾体类似物BungsteroidA。由碳谱、ECD和旋光度计算确定，它具有的C34五环（6/6/6/6/5）甾体类似物骨架。6/6/6/6/5骨架只是在一个合成专利中被报道，而且五环甾体也并不常见的。BungsteroidA具有C34五环甾体类似物的第一个碳骨架和连接在甾体环C-2和C-3的异戊二烯。通过光谱分析和量子化学计算确定了其化学结构。提出1的生物合成途径，其中该碳骨架可能是通过甲戊二酸途径将二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）单元环加成到2β，3β-二羟基甾体杯苋甾酮的A环上。并测试了BungsteroidA抗HepG2、MCF-7和HeLa细胞系增殖活性。
提取分离
干燥花椒果皮（5.0kg）室温下用70%乙醇水提3次（3×50L，每次7天）。浓缩得到粗提物，溶于水，并用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。浓缩乙酸乙酯部分以得到残留物（g），然后使用CH2Cl2/MeOH（从30:1到0:1，v/v）的梯度进行硅胶柱层析（CC），得到12个部分（B1?B10）。用SephadexLH-20（50%甲醇水）对馏分C5（mg）进行压裂，得到C5-1?C5-7。HPLC纯化C5-4（用60%甲醇水洗脱，流速4mL/min）得到化合物1（17.0mg，tR=8.6min）。
结构解析
BungsteroidA，白色无定形粉末，旋光度[α]D20+64.8(c0.3,甲醇)，HRESIMSm/z.[M+Na]+，分子式为C34H50O8。红外：羟基(cm?1)，羰基(cm?1)，双键(cm?1)。紫外：λmax(3.26)，说明存在α,β-不饱和羰基。
碳谱显示了34个碳信号，氢谱和碳谱（氘代丙酮溶剂）数据显示，存在四个叔甲基，δH0.93(H3?22)、0.96(H3?23)、1.59(H3?24)、1.22(H3?26)，δC17.0、25.2、22.3、19.9（C-22、C-23、C-24、C-26）；两个仲甲基，δH1.26（d,J=7.2Hz,H3?32）、1.38（d,J=6.0Hz,H3?34），δC15.0、18.7（C-32、C-34）；一个三取代烯键，δH5.23(d,J=2.4Hz,H-2)，δC.3(C-2)、.2(C-3)；一个三代的α,β-不饱和羰基，δH5.75(s,H-13)，δC.2(C-12)、.6(C-13)、.5(C-14)；一个酯基，δC.2(C-31)；两个连氧次甲基，δH3.59(dd,J=10.8,4.8
Hz,H-27)、4.19(dq,J=9.0,6.0Hz,H-33)，δC73.5、79.3(C-27、C-33)；四个含氧碳信号δC70.9、71.4、83.7、76.2(C-5、C-10、C-18、C-25)，五个羟基信号δH3.64、3.46、3.96、3.30、3.77(OH-5、OH-10、OH-18、OH-25、OH-27)。
以氘代吡啶为溶剂，从H-7到H-33（除了H-9和H-24外）的氢谱数据和从C-5到C-33（除C-9、C-10和C-24外）的碳谱数据与已知的杯苋甾酮的数据相似，表明化合物1是C34五环甾体，异戊二烯部分连接到杯苋甾酮的C-2和C-3上形成一个六元环（Figure1，A环），并且结构通过2DNMR光谱分析进一步阐明。
以氘代丙酮为溶剂，1H?1HCOSY交叉峰（Figure2），及HMBC相关性（Figure2），H-1b和C-3、C-5、C-9、C-10，H-2和C-4、C-10，H2-4和C-2、C-3、C-5、C-6，H3-24和C-2、C-3、C-4，表明存在A环和连在C-3上的甲基（C-24）。此外，在H2-6/H-7、H-11/H2-15/H2-16、H2-19/H2-20/H-21、H-27/H2-28/H-29/H-30/H3-32和H-29/H-33/H3-34的1H?1HCOSY（氘代丙酮）交叉峰表明存在含有邻位偶合结构。HMBC相关性，H-7和C-5、C-8、C-9、C-11、C-13、C-14，H2-9和C-5、C-7、C-8、C-10、C-11，H-11和C-8、C-12、C-13、C-15，H-13和C-8、C-11、C-18，H-13和C-8、C-11、C-18，H-15a和C-7、C-11、C-12，H2-16和C-11、C-15、C-17、C-18，H-19b和C-17、C-18、C-21，H-20b和C-17、C-21，H-21和C-16、C-17、H3-22和C-16、C-17、C-18、C-21，H3-23和C-7、C-8、C-9、C-11，表明存在B、C、D和E环，以及OH-5和C-5、C-6、C-10，OH-10和C-1、C-5、C-9、C-10，OH-18和C-17、C-18、C-19，表明OH-5、OH-10和OH-18与分别是C-5、C-10和C-18。此外，H-27/H2-28/H-29/H-30/H3-32；H-29/H-33/H3-34的1H?1HCOSY交叉峰，以及H-21和C-27，H3-26和C-21、C-25、C-27，H-30、H3-32和C-31，OH-25和C-21、C-25、C-26，OH-27和C-27、C-28的HMBC相关性，再加上它们的核磁共振化学位移和质子与碳共振的偶合常数，证明了半胱氨酸的存在。从而确定了化合物1的平面结构。
根据NOESY（氘代丙酮）数据确认了1的相对构型（Figure3）。H-6b/H-7/H3-23/H3-22、H-27/H-29/H3-32、H3-34/H-29和H3-22/OH-25的NOESY相关性表明，这些质子（H-7、H3-22、H3-23、H-27、H-29、H3-32、H3-34和OH-25）均为β取向，与杯苋甾酮中的一致。H-11/H-19a、H-19a/H-21、H-21/H3-26、H-30/H-28a/H-33、OH-27/H3-26和H-21/OH-18的NOESY相关性表明，这些质子（H-11、H-21、H3-26、OH-18和OH-27）均为α取向的。同时，OH-5/H-7、OH-5/H-6b和H-7/H-6b的相关性表明OH-5为β取向，OH-10/H-9b、H-9b/H-6a和H-9b/H-11/H-6a的相关性表明OH-10为α取向。因此，确定1的相对构型，结构如1d所示（Figure4）。此外，对化合物1的4个相对构型（1a?1d，甲醇，Figure4）的量子化学13CNMR数据进行分析，R2值0.（1a）和0.（1d）（Figure4），表明1a和1d是最可能的相对构型。总体而言，NOESY实验和量子化学13CNMR数据证实1的相对构型如1d所示。
通过ECD计算和旋光计算确定了1的绝对构型。计算了四种相对构型（1a?1d）的ECD。如Figure5所示，1d在PBE1PBE-aug-cc-pVTZ水平下计算的比旋度（+51.8°，甲醇）与实验值（+64.8°）一致。由此推断1的绝对构型为1d，命名为bungsteroidA。
生物合成途径
在Scheme1中提出了一个合理的bungsteroidA（1）生物合成途径。生物前体认为是杯苋甾酮，杯苋甾酮与从Z.bungeanumMaxim中分离得到的β-谷甾醇具有相同的碳骨架。
化合物1推测是由二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）单元经甲戊二羟酸途径环加成杯苋甾酮A环而得到的。
生物活性
用CCK-8检测1对HepG2、MCF-7和HeLa细胞系的抗增殖活性。三种细胞分别培养在96-孔板24小时（细胞/孔）。之后,细胞用不同浓度(0.01、0.1、1、2、10、20、50、和μM)化合物1处理24h。培养基中加入μLDMEM（含10μLCCK-8）。混合物在37℃暗箱中培养1小时，用酶标仪(Thermo,USA)在nm处测定吸光度。对化合物1进行抗HepG2、MCF-7和HeLa细胞株增殖活性筛选，IC50值分别为56.3±1.1、64.2±0.9和74.2±1.3μM。活性与杯苋甾酮相当，说明加入A环对其抗增殖作用没有影响。
ending
本文于年7月24日在线发表于杂志：TheJournalofOrganicChemistry，第一作者为Xian-HuaMeng和TianChai，通讯作者为Jun-LiYang，中国科学院兰州化学物理研究所为通讯单位。
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